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TUNEL凋亡顯色法
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）法檢測細胞凋亡的原理是當細胞發生凋亡時，DNA內切酶被激活，核小體間的基因組DNA被切斷，暴露的3'-OH可以在末端脫氧核苷酸轉移酶（Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TdT）加上帶有生物素（Biotin）標記的dUTP即Biotin-dUTP,隨后于辣根過氧化物酶（HRP）標記的streptavidin結合，在HRP的催化下通過DAB顯色來顯示凋亡細胞，從而可以通過普通光學顯微鏡檢測到細胞凋亡。
實驗意義
1. TUNEL法是一種分子生物學與形態學相結合的研究方法，可對完整的單個凋亡細胞或者凋亡小體進行原位染色，可以準確反映細胞凋亡最典型的生物化學和形態特征。
2. 可用于石蠟切片、冰凍切片、培養的細胞等進行細胞凋亡檢測，靈敏度遠比一般的組織化學和生物化學方法要高。
3. 操作簡便快捷，在細胞凋亡的研究中被廣泛采用。
實驗步驟
1.石蠟切片TUNEL顯色法：
①石蠟切片常規脫蠟至水，脫蠟劑二甲苯，至水劑乙醇；
②PBS漂洗3×5 min；
③加入蛋白酶K工作液37℃反應15-30 min, PBS漂洗3×5 min；
④4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室溫固定15-30 min，PBS漂洗3×5 min；
⑤浸入封閉液（3%H2O2）室溫封閉10 min，PBS漂洗3×5 min；
⑥加入適量TdT酶反應液，暗濕盒中37℃反應1 h，用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3×5 min；
⑦浸入0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min，PBS漂洗3×5 min；
⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反應30-60 min，PBS漂洗3×5 min；
⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數次；
⑩選擇是否用DAPI復染細胞核；
?脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。
2.冰凍切片TUNEL顯色法：
①新鮮組織經處理后，立即在恒冷冰凍切片機內切片，厚度為5~6 μm；
②防脫玻片，貼片，室溫陰干約12 h；
③4%多.聚.甲.醛（pH7.4的PBS）室溫固定10 min，PBS漂洗3×5 min；
④浸入封閉液（3%H2O2）室溫封閉10 min，PBS漂洗3×5 min；
⑤浸入通透液（0.1%Triton X-100溶于PBS中），室溫通透30 S-2 min；
⑥加入適量TdT酶反應液，暗濕盒中37℃反應1 h，用SSC室溫15 min終止反應后,PBS漂洗3×5 min；
⑦浸入0.3% H2O2封閉內源性過氧化物酶活性，室溫孵育3-5 min，PBS漂洗3×5 min；
⑧滴加Streptavidin-HRP工作液，37℃反應30-60 min，PBS漂洗3×5 min；
⑨滴加DAB顯色液后用去離子水漂洗數次；
⑩選擇是否用DAPI復染細胞核；
?脫水、透明、中性樹膠封片后進行觀察。
結果展示
實驗完成周期及交付標準
1. 實驗周期：1-2周
2. 交付標準：蠟塊、切片、染色圖片、實驗報告（實驗步驟、試劑、耗材等）
需確認的信息
1. 樣本的種屬
2. 樣本的類型（固定的組織or蠟塊or切片）
3. 是否提供試劑盒
4. 拍照要求
參考文獻
[1] Bing L , Ying-Jie X , Xian-Ming C , et al. Molecular mechanism of inhibitory effects of CD59 gene on atherosclerosis in ApoE (-/-) mice[J]. Immunology Letters, 2013, 156(1-2):68-81.
[2] Ozimati A A . Immunodetection of Smad-4 in developing molar roots of alendronate-treated rats[J]. Archives of Oral Biology, 2013, 58(11):1744-1750.
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晶萊實驗服務流程
晶萊生物實驗服務項目
| 動物實驗 | 細胞生物學 | 病理實驗 |
| 消化系統模型 | 細胞培養 | 病理染色 |
| 胃酸分泌模型 | 普通細胞株 | HE染色 |
| 膿毒癥模型 | 細胞缺氧培養 | 油紅O染色 |
| 胃潰瘍模型 | 細胞培養+支架 | 番紅固綠染色 |
| 胰腺炎模型 | 干細胞培養 | Masson染色 |
| 肝纖維化模型 | 原代細胞分離/提取/培養 | 天狼猩紅染色 |
| DIO肥胖模型 | 細胞轉染/病毒感染 | PAS糖原染色 |
| 膽結石模型 | Trans well共培養 | 阿利新藍染色 |
| 結腸炎(UC)模型 | 細胞增殖 | 甲苯胺藍染色 |
| 脂肪肝模型 | 細胞計數 | 尼氏染色 |
| 急性肝損傷模型 | 生長曲線測定 | LFB髓鞘染色 |
| 免疫、代謝系統疾病模型 | 存活曲線測定 | 普魯士藍染色 |
| 骨質疏松模型 | ccK-8增殖檢測 | VG染色 |
| 糖尿病模型 | MTT增殖檢測 | EVG染色 |
| 高尿酸血癥模型 | CFSE檢測增殖-流式檢測 | VonKossa染色 |
| 呼吸系統模型 | BrDU檢測-免疫熒光法 | 剛果紅染色 |
| 肺纖維化模型 | 細胞凋亡 | 蘇丹黑B染色 |
| 慢性肺阻塞模型 | Annexin V/PI流式檢測細胞凋亡 | Trap染色 |
| 急性肺損傷模型 | WB檢測凋亡相關蛋白 | 抗酸染色 |
| 哮喘模型 | 透射電鏡觀察凋亡小體 | 革蘭氏染色 |
| 肺栓塞模型 | Tunel染色(POD法,DAB顯色) | AB-PAS染色 |
| 支氣管炎模型 | Tunel(熒光法,含試劑盒) | 亞甲基藍染色 |
| 泌尿生殖系統模型 | DNA ladder法 | 苯胺藍染色 |
| 慢性腎衰模型 | 細胞周期 | 熒光 DAPI染色 |
| 急性腎衰模型 | 細胞顯微計數 | 普魯士藍染色 |
| 腎間質纖維化模型 | PI染色 | 間苯二酚堿性品紅染色 |
| 腎結石模型 | BrdU滲入法 | 銀染 |
| 腎炎模型 | 免疫熒光染色 | 黑色素染色 |
| 子宮內膜異位癥模型 | PI流式檢測細胞周期 | 鍍銀染色 |
| 心血管系統模型 | 細胞運動 | PASM 六胺銀染色 |
| 冠心病模型 | Transwell檢測細胞遷移 | VG染色 |
| 心肌梗死模型 | Transwell檢測細胞侵襲 | 富爾根染色 |
| 心臟驟停模型 | 細胞劃痕 | 亞甲基藍染色 |
| 慢性心力衰竭模型 | 細胞克隆 | 碘-碘化鉀染色 |
| 動脈粥樣硬化模型 | 集落形成法/稀釋鋪板方法 | Goldner三色法染色 |
| 白血病模型 | 軟瓊脂克隆法 | PAS-萘酚磺S染色 |
| 高血壓模型 | 毛細管克隆法 | 改良苯酚品紅染色 |
| 神經系統模型 | 體外實驗血管生成 | 網狀纖維染色 |
| 腦卒中模型 | 磁珠分選細胞 | β-半乳糖苷酶染色 |
| 栓塞性腦梗死模型 | 流式分選細胞 | 鍍銀染色 |
| 腦出血模型 | 開機費 | movat五色染色 |
| 腦損傷模型 | 單色 | 維多利亞藍染色 |
| 脊髓損傷模型 | 雙色 | 免疫組化 |
| 帕金森模型 | CBA多細胞因子流式檢測 | 免疫組化預式 |
| 老年癡呆模型 | 組織/血液細胞制備 | 免疫組化正式 |
| 應激模型 | 組織單細胞制備 | 免疫熒光（石蠟-單標） |
| 骨骼疾病模型 | 中性粒細胞提取 | 免疫熒光（石蠟-雙標） |
| 骨折模型 | 其他樣本細胞制備（如血液等） | 免疫熒光（石蠟-三標） |
| 骨缺損模型 | 外周血PBMC分離 | 免疫熒光（冰凍-單標） |
| 風濕免疫性關節炎模型 | 線粒體組學 | 免疫熒光（冰凍-雙標） |
| 骨關節炎模型 | 線粒體膜電位檢測-流式法 | 制片前處理 |
| 五官疾病模型 | 線粒體膜電位檢測-免疫熒光法 | 石蠟組織包埋 |
| 眼科疾病模型 | 線粒體ROS生物含量檢測--流式 | 特殊包埋（細胞、材料、眼球等） |
| 鼻腔疾病模型 | 線粒體ROS生物含量檢測--免疫熒光 | 軟化（肝硬化、皮膚結痂、植物等） |
| 皮膚疾病模型 | 線粒體通透性轉換孔（mPTP） | 骨組織脫鈣（?。?/span> |
| 皮膚損傷模型 | 溶酶體免疫熒光法 | 骨組織脫鈣（大） |
| 腫瘤疾病模型 | 線粒體+溶酶體共定位 | 骨組織EDTA脫鈣（?。?/span> |
| 原位瘤模型 | 內質網 | 骨組織EDTA脫鈣（大） |
| 轉移瘤模型 | 線粒體鈣瞬時變化檢測-流式 | 石蠟白片 |
| 皮下植瘤模型 | ATP檢測 | 細胞爬片 |
| ADP檢測 | ||
| AMP檢測 | ||
| 流式 | DNA/RNA半定量檢測 | 基因編輯工具 |
| 組織細胞懸液處理 | pcr檢測mRNA | 合成（3保1）片段/質粒/引物合成 |
| 細胞處理 | microRNA檢測 | 質粒載體構建 |
| 血液標本處理 | LncRNA表達量的檢測 | 過表達腺病毒載體構建包裝 |
| 細胞刺激培養 | CirRNA表達量的檢測 | shRNA腺病毒載體構建包裝 |
| 單色檢測 | 凝膠電泳 | 過表達慢病毒載體構建包裝 |
| 雙色檢測 | 基因合成 | shRNA慢病毒載體構建包裝 |
| Annexin V/PI凋亡 | ＜300 | 過表達腺相關病毒載體構建包裝 |
| 細胞周期 | 300-1,500 | shRNA腺病毒載體構建包裝 |
| 1500 - 5000 | 穩轉細胞株 | |
| >5000 | ||
| 特殊序列 | ||
| ELISA | WB | qPCR |
| 組織勻漿處理 | 蛋白提取及定量一 | RNA抽提 |
| ELISA（不含試劑盒）48T/kit | WB檢測一（10孔膜/指標） | mRNA引物設計及合成 |
| ELISA（不含試劑盒）96T/kit | 灰度值分析及作圖一（10孔膜/指標） | miRNA引物設計及合成 |
| ELISA（含國產試劑盒）48T/kit | 蛋白提取及定量二 | LncRNA引物設計及合成 |
| ELISA（含國產試劑盒）96T/kit | WB檢測二（10孔膜/指標） | CircRNA引物設計及合成 |
| 灰度值分析及作圖二（10孔膜/指標） | mRNA RT-qPCR | |
| miRNA RT-qPCR | ||
| LncRNA RT-qPCR | ||
| CircRNA RT-qPCR |
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